科研 | Food Chem：用1H-NMR分析牛肉代谢组极性组分

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编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

牛肉的嫩度和口感可以通过干陈或湿陈或两者结合来改善。本研究的目的是建立一种有效的方法来检测干陈和湿陈牛肉在陈化过程中代谢组分极性部分的差异，并利用牛肉的¹H-NMR谱对相关代谢产物进行定量。我们采用不同老化方式（湿老化、干老化）和不同老化时间（0、7、14、21、28 d）的60条牛前腰脊肉样品进行分析；用线性判别分析可确定衰老类型，准确率达95%。18种代谢物中有10种（乳酸、丙氨酸、蛋氨酸、富马酸、肌苷、肌苷单磷酸、肌酸、甜菜碱、肌肽和次黄嘌呤）的含量因老化类型不同而有显著差异（p<0.05）。干陈牛肉中有15种代谢产物与陈化时间相关（r>0.7，<0.7），而湿陈牛肉中有10种代谢产物与陈化时间相关（r>0.7，<0.7）。

论文ID

原名：Analysis of aging type- and aging time-related changes in the polar fraction of metabolome of beef by 1H-NMR spectroscopy译名：用¹H-NMR分析牛肉代谢组极性组分随老化类型和老化时间的变化
期刊：Food Chemistry
IF：7.514发表时间：2021.04通讯作者：Monika Gibis
通讯作者单位：德国霍恩海姆大学

实验设计

实验结果

牛肉提取物经¹H-NMR谱分析。图1显示了牛肉水提取物（左腰部，d=0）的代表性¹H-NMR谱。我们用qNMR对18种代谢物次黄嘌呤、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、肌肽、富马酸、IMP、肌苷、甜菜碱、肌酸、蛋氨酸（Met）、谷氨酰胺（Glu）、乙酸、乳酸、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）的信号进行定量分析，通过测量分析标准化合物并将其与文献进行比较来识别信号。图1 牛肉提取液在90% H₂O+ 10% D₂O条件下的极性代谢物¹H-NMR谱
 1. 验证
验证结果如表1所示。肉类中18种代谢物的线性测定系数范围为0.9936至0.9999，并与果汁的qNMR文献进行了比较。方法的精密度在4.34~7.50之间，两个异常值分别为11.52（肌酸）和13.64（富马酸）。测量精度的标准偏差小于2%。与文献相比，¹H-NMR的测量不确定度为1.5%。回收率的相对损失有两个异常值，分别为49.38%（富马酸）和62.56%（乙酸），因为这两种酸都是挥发性的，在实验的干燥步骤中都会损失。此方法的准确率在107.74-80.95%之间，两个异常值分别为57.11%（乳酸）和127.46%（富马酸）。由信噪比计算的LOD和LOQ值取决于观测到的信号和质子数。与Monakhova等人（2014年）相比，我们研究中的LOD和LOQ值显示了一个下限。我们分析了果汁样品的LOD和LOQ，并在信噪比的计算中加入了因子2。另外，在本分析中，由于重叠信号导致不同代谢物之间的影响，样品基质被排除在外。 表1 通过qNMR计算出在0、7、14、21和28天老化时间下，16种代谢物含量与老化类型(湿老化和干老化)的相关系数验证结果
2. 牛肉的非靶向NMR分析
¹H-NMR谱用于非靶向分析。通过光谱的统计分析，我们将牛肉样品区分为两种老化类型。
2.1 老化类型的影响
除鲜肉样品光谱（d=0）外，其余7、14、21和28日龄牛肉样品的光谱均用于统计分析。图2显示基于¹H-NMR谱测量的样品的LDA模型，以95%的准确率将样品分类为老化类型。此外，PLS-DA和OPLS-DA分析（图2）说明样本可以根据其老化类型进行区分。LDA使组间方差相对于组内方差最大化。LDA的缺点是要处理大量的变量，这就是为什么要提前进行PCA来降低维数。在PLS-DA中，我们利用分组成员关系，允许在得分空间中更好地区分群体，而基于PLS-DA的OPLS-DA模型包含了正交信号的校正。PLS-DA和OPLS-DA的缺点是倾向于过度拟合，三个模型都显示了对衰老类型的区分，图S1和S3a显示了不同老化类型之间光谱的主要差异。除了使用特定的氨基酸作为老化类型变化的指标外，以非靶向方式使用的核磁共振波谱导致了识别所应用的老化类型的可能性。非定向分析考虑到了光谱中无法量化但可能对识别老化类型很重要的信号，而这可能是由于在4到2 ppm的光谱中信号的叠加。例如，这区域的信号来自不同的糖，如葡萄糖、果糖和甘露糖，或其他化合物，如甘油。老化牛肉的代谢组学差异主要是由于游离氨基酸的含量，如谷氨酸或核苷酸。Kim等人发现，干陈牛肉中的谷氨酸含量明显高于其他陈化方法的样品。此外，文献报道，湿陈牛肉中次黄嘌呤的增加高于干陈牛肉，而干陈牛肉中IMP和肌苷的增加更高。肌苷和次黄嘌呤是肌肉能量代谢的产物。此外，微生物对湿陈和干陈牛肉风味前体的含量也有影响。早期的一项研究发现，作为非运动细菌模型系统的胶体颗粒能够扩散到肌肉密集的纤维结构中。这种尚不为人所知的差异和变化，同样以非针对性的方式记录下来。综上所述，在本研究中，老化类型（湿老化或干老化）影响代谢组，这可能导致风味和/或嫩度的变化，如其他研究所述。 图2 用偏最小二乘判别法(PLS-DA)、正交偏最小二乘判别法(OPLS-DA)和线性判别法(LDA)对陈化型牛肉进行了研究
湿陈化(浅灰色)和干陈化(深灰色)样品用于分析。小点代表模型集，而大点代表测试集。测试集为随机选取的8个样本来检验统计模型。椭圆描述了两组的95%置信区间。 2.2 老化时间的影响
我们利用所有陈化和新鲜牛肉样品的每个光谱分析在特定时期（0、7、14、21和28天）陈化过程中代谢组的变化，图3显示了老化时间相关的变化作为样品代谢组中的动态时间依赖性过程。我们对每种老化类型分别进行PLS-R、OPLS-R和PCR分析，三种回归方法均呈显著回归（p<0.01），R²测定系数在0.925（PCR；湿）和0.988（PLS-R；干燥）之间。新鲜牛肉样品（d=0）和两种陈化类型的样品在陈化28天后的差异最大（图S3B和C），其中第0天、第14天和第28天的样本具有显著性差异。两种陈化类型的回归分析表明，随着陈化时间的延长，干陈和湿陈牛肉代谢组分的极性组分存在显著差异。与这些结果相比， OPLS-R结果显示10周的老化时间（每两周采样一次）会影响代谢组；老化28天后，总游离氨基酸含量、肌苷和次黄嘌呤含量显著增加，IMP含量下降。关于衰老时间的代谢组学变化是非靶向治疗的基础，我们在其NMR研究中鉴定了60种代谢物，并报告了通过分析牛肉渗出物预测牛肉老化时间的PLS模型，这为肉类的核磁共振研究提供了基础。另外，在本研究中，我们开发了一种有效的方法来检测干陈和湿陈牛肉中代谢组分极性部分随老化时间的差异，并用于定量感兴趣的代谢物。本研究主要目标是研究不同老化类型的老化时间。所以在目前的研究中，牛肉渗出液的取样和真空包装下24小时的取样不适合达到目前的目标。 图3 对牛肉老化时间进行偏最小二乘回归(PLS-R)、正交偏最小二乘回归(OPLS-R)和主成分回归(PCR)
采用湿陈化、干陈化和新鲜牛肉样品进行分析。对5种不同老化时间(0、7、14、21和28天)的样品进行了湿老化和干老化分析。每老化时间和老化类型各6个样品。不同回归的决定系数R2为0.988 (PLS-R;干)，0.969 (PLS-R;湿)，0.967 (OPLS-R;干)，0.969 (OPLS-R;湿)，0.943 (PCR;和0.925 (PCR;湿)。 3. 衰老类型与衰老时间组合对代谢组的影响
我们的假设是，通过¹H-NMR谱的测量可以区分干陈和湿陈牛肉样品，以证明老化方法的真实性。老化时间的结果清楚地表明，通过非靶向光谱进行统计分析，可以根据老化类型对样品进行分类。¹H-NMR谱的变化是由于老化类型和老化时间不同而引起的代谢组学的变化。我们通过数据分析和文献调研共鉴定了18种代谢物，可以作为老化的指标。28天干老化和湿老化样品的光谱变化如图4所示。根据图4，我们计算了代谢物亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、乳酸、富马酸、肌苷、IMP、肌酸、甜菜碱、肌肽、乙酸、次黄嘌呤和色氨酸随老化时间的含量变化（图5）。18种代谢物的含量与老化时间的相关系数（表1）表明，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的含量随老化时间的延长而增加，但与老化类型无关。此外，谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和乙酸的含量与陈化类型没有相关性，而除乙酸含量外，湿陈牛肉的含量高于干陈牛肉，这种发展对于延长老化时间可能具有更高的重要性。老化28天后，游离氨基酸含量的增加与Oh等人（2018）的研究结果一致，并取决于蛋白质降解。结果表明，谷氨酸和色氨酸含量与衰老类型无关。Kim等人（2017）研究结果显示，湿陈牛肉中的谷氨酸含量高于干陈牛肉，而Kim等人（2016）报告的干陈牛肉中的谷氨酸含量较高。这可能是由于老化时间较短，或样品来自其他繁殖条件的动物。随着老化时间的延长，IMP含量降低，而肌苷和次黄嘌呤含量增加。在僵硬的新陈代谢过程中，IMP被降解为肌苷，并进一步降解为次黄嘌呤。这些代谢产物与衰老时间和衰老类型有关。与Kim等人（2016）的观察相反，干陈牛肉的IMP含量高于湿陈牛肉（三周龄），而IMP、肌苷和次黄嘌呤的结果与Kim等人（2019）和Oh等人（2018）的研究结果一致，他们报告干陈牛肉的IMP和肌苷含量较高，次黄嘌呤含量较湿陈牛肉低，与能量代谢相关的代谢物的不同发育取决于核苷磷酸化酶的活性。18种代谢物中有10种在老化时间为14、21和28天的干老化和湿老化样品之间存在显著差异（t检验，p<0.05）。干陈牛肉中乳酸、丙氨酸、蛋氨酸、富马酸、肌苷、肌苷、肌酸、甜菜碱和肌肽的含量高于湿陈牛肉，次黄嘌呤的含量低于干陈牛肉（28天；图5）。延胡索酸、肌酸、肌肽和乳酸的含量与陈化时间的相关系数随陈化时间的延长而增加。代谢产物含量的变化取决于老化类型，干陈牛肉中乳酸含量随着陈化时间的延长而增加。乳酸是死后糖酵解的产物，厌氧条件下在肌肉中积累，牛肉老化过程中乳酸含量随老化时间而变化。Kodani等人（2017）报告，湿陈牛肉中的乳酸含量随着陈化时间的延长而降低，而Graham等人（2010）则报告乳酸含量增加。在本研究中，不同陈化方法之间乳酸含量的差异可能是由于干陈牛肉的失重率和细菌总数高于湿陈牛肉引起。与肌肉能量代谢有关的肌酸含量在湿牛肉中表现出停滞，这与Graham等人（2010）和Koutsidis等人（2008a）的研究结果一致。在牛肉样品中，18个老化时间相关系数中有15个（干陈）和12个（湿陈）高于0.7或低于0.7。乳酸、丙氨酸、蛋氨酸、肌苷、IMP、苯丙氨酸、肌酸、肌肽和乙酸等代谢产物在干陈和湿陈牛肉中的相关系数相差0.09。代谢物极性组分中的一些代谢物是熟牛肉的风味前体。氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，以及次黄嘌呤和肌苷都有苦味；苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸和乳酸会产生酸味；蛋氨酸与鲜味有关，肌酸和肌肽的含量影响牛肉的风味和多汁性；谷氨酸和IMP也与鲜味有关。代谢产物含量的差异可以解释湿陈牛肉和干陈牛肉在风味和嫩度方面的差异。探索湿陈牛肉和干陈牛肉在风味和嫩度方面的差异是可以实现的，因为使用非靶向的¹H-NMR谱进行统计分析，可以区分两种类型的老化。此外，还对与衰老过程中代谢组学变化相关的关键化合物的含量进行了定量分析，并显示出不同衰老时间之间的明显差异。大多数被分析的这些物质，如谷氨酸盐和IMP，被称为熟肉的典型风味前体。 图4 干陈化和湿陈化样品中(A)游离氨基酸和(B)其他代谢物¹H-NMR信号与陈化时间的比较(0、7、14、21和28天)
 图5 干陈化和湿陈化样品中(A)游离氨基酸和(B)其他代谢物浓度的比较(0、7、14、21、28天)
代谢物含量的计算基于qNMR所用的¹H-NMR谱。

结论

¹H-NMR分析结果表明，该方法具有样品量小的优点，适用于牛肉陈化过程中多种代谢物的直接、同时、快速测定。通过¹H-NMR谱分析牛肉样品，可以验证老化类型，牛肉代谢组分的极性组分随陈化类型和陈化时间的不同而变化。为了扩展统计模型，研究感兴趣的衰老类型和衰老时间，需要进行更多的动物试验。此外，在牛肉的代谢组中还需要考虑更多的参数，例如饲料和品种。所以今后的研究重点将放在老化牛肉的感官评价上，这有助于将检测到的代谢物与熟牛肉的味道和风味联系起来。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33092915/

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